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    1. 文章詳情

      酵母(Yeast)H+ATP酶(H-ATPaseELISA檢測試劑盒使用說明書

      日期:2022-06-24 10:05
      瀏覽次數:1149
      摘要:檢測原理 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯**吸附試驗(ELISA)。往預先包被H+-ATP酶(H-ATPase)抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的H+-ATP酶(H-ATPase)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品活性。

      樣品收集、處理及保存方法

      1.  樣本不能含疊氮鈉(NaN3),因為疊氮鈉(NaN3)是辣根過氧化物酶(HRP)的抑制劑。

      2.  標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行。

      3.  植物萃取液或其它相關樣本:請1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測。

      4.  保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

      自備物品

      1. 酶標儀(450nm)

      2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

      3. 37℃恒溫箱

      操作注意事項

      1.  試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正?,F象,水浴加熱使結晶完全溶解后再使用。

      2.  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

      3.  濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白;按照說明書操作時樣本已經稀釋5倍,*終結果乘以5才是樣本實際濃度。

      4.  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

      5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

      試劑盒組成

      名稱

      96孔配置

      48孔配置

      備注

      微孔酶標板

      12孔×8條

      12孔×4條

      標準品

      0.3mL*6管

      0.3mL*6管

      樣本稀釋液

      6mL

      3mL

      檢測抗體-HRP

      10mL

      5mL

      20×洗滌緩沖液

      25mL

      15mL

      按說明書進行稀釋

      底物A

      6mL

      3mL

      底物B

      6mL

      3mL

      終止液

      6mL

      3mL

      封板膜

      2張

      2張

      說明書

      1份

      1份

      自封袋

      1個

      1個

      注:標準品(S0-S5)濃度依次為:0、30、60、120、240、480 IU/mL

      試劑的準備

       20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

      洗板方法

      1.  手工洗板:甩盡孔內液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。

      2.  自動洗板機:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

      操作步驟

      1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

      2.  設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

      3.  樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。

      4.  除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

      5.  棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。

      6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

      7.  每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。

      結果判斷

       繪制標準曲線:在Excel工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應OD值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。

       

       

      試劑盒性能

      1.  準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值,大于等于0.9900。

      2.  靈敏度:*低檢測濃度小于1.0 IU/mL。

      3.  特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

      4.  重復性:板內、板間變異系數均小于15%。

      5.  貯藏:2-8℃,避光防潮保存。

      6.  有效期:6個月

      免責聲明

      1.   試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或人體實驗,否則所產生的一切后果,由實驗者承擔,本公司概不負責。

      2.   嚴格按照說明書操作,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者承擔。

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